Toska, kas negaidīti uzaicināta dziedāt ķēniņienes Marijas Karolīnas rīkotajā banketā Farnēzes pilī, atgriežas baznīcā, lai paziņotu Kavaradosi par izmaiņām vakara satikšanās plānos. Viņa kļūst par Skarpijas apmāna upuri, jo sāk ticēt barona norādēm par Kavaradosi un marķīzes Atavanti attiecībām. Greizsirdības uzliesmojumā Toska traucas uz ārpilsētas namiņu, policijas okšķeriem tādējādi sniedzot jaunus pavedienus izbēgušā politieslodzītā meklējumos.
II Palazzo Farnese Skarpija vakariņo Farnēzes pils kabinetā. Viņš gaida ziņas par Andželoti sagūstīšanu un domā par Tosku. Andželoti vietā tiek atvests Kavaradosi, kura personība un drosmīgā izturēšanās Skarpiju kaitina. Iesāktās nopratināšanas skarbums kontrastē ar Toskas dziedājumu, kas dzirdams no svētku norises vietas.
Jūtot, ka gleznotājs ir nesalaužams, Skarpija nolemj iegūt viņam nepieciešamo informāciju citādākā veidā. Toskai, kas pēc kantātes atskaņojuma uzaicināta ierasties Skarpijas kabinetā, jāklausās spīdzinātā Kavaradosi vaidos. Viņa nespēj to izturēt un beidzot izpauž Andželoti slēptuves vietu. Izvārgušais Kavaradosi nolād Toskas mazdūšību.
Skarpijas palīgs Šarone paziņo jaunumus. Izrādās, ka monarhisti, kuru uzvara šovakar tiek svinēta, kaujā pie Marengo patiesībā cietuši sakāvi. Kavaradosi sajūsma par Napoleona panākumiem apzīmogo viņa likteni: Skarpijam tiek dāvāta izdevība pasludināt kvēlajam republikānim nāvessodu.
Toskas cerība, ka mīļotā cilvēka dzīvība varētu tikt nopirkta par naudu, tiek sagrauta. Skarpija šajā darījumā vēlas iegūt pašu Tosku. Veltīgas ir dziedones lūgšanas, jo tās tikai pastiprina Skarpijas iekāri.
Ierodas Spoleta, lai paziņotu, ka Andželoti aresta laikā izdarījis pašnāvību.
Skarpija pēdējo reizi vaicā Toskai, vai tā piekrīt viņa noteikumiem. Saņēmis pozitīvu atbildi, viņš dot dod pavēli šaut uz Kavaradosi ar tukšām patronām, piebilstot, ka visam jābūt tieši tāpat kā grāfa Palmjēri gadījumā. Toska nenojauš, ka Skarpijas nesaprotamā piebilde nozīmē nevis šķietamu, bet pavisam īstu nāvessoda izpildi.
Brīdī, kad Skarpija paraksta atļauju Toskai un viņas pavadonim rītausmā pamest Romu, dziedātāja ierauga nazi, kuru Skarpija lietojis vakariņu laikā. Viņa to noslēpj aiz muguras. Izmantojot Skarpijas vēlmi apkampties, ietriec nazi tirāna krūtīs. Skarpija mirst.
III Castel Sant'Angelo Uz Eņģeļa cietokšņa jumta tiek atvests Kavaradosi. Viņš atdod savu gredzenu cietumsargam, lai varētu netraucēti uzrakstīt atvadu vēstuli mīlotajai. Negaidīti ierodas pati Toska un stāsta par pēdējiem notikumiem Skarpijas darbistabā. Dziedātāja kopā ar Kavaradosi sapņo par laimīgo nākotni.
Ierodas kareivji. Toska no tālienes vēro nāvessoda izpildi, uzskatot, ka tas ir tikai teātris. Atskan šāvieni, Kavaradosi krīt. Toska pēc brīža atskārst, ka Skarpija viņu piekrāpis. Gleznotājs ir miris.
Atskan policijas okšķeru satrauktās balsis: kabinetā atrasts nogalinātais Skarpija. Barona rokaspuisis Spoleta cenšas aizturēt Tosku, bet viņa, lecot no Eņģeļa cietokšņa jumta, izvēlas nāvi brīvībā.